实验方法

Western Blot是一种十分常用的检测目的蛋白的方法。该方法通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，将总蛋白样本按分子量大小分离，再通过电转将凝胶上的蛋白转移至固相载体PVDF膜或NC膜上，利用特异性抗体（一抗）与目标蛋白发生免疫反应，再由带有HRP酶标记的二抗与一抗结合，通过显色试剂与酶标二抗发生显色反应，根据显色位置与信号强弱从而判断目的蛋白在细胞或组织中的表达情况。蛋白免疫印迹实验步骤

注意：本实验步骤为Western Blot常规实验步骤，由于WB实验在不同实验室都各有改良，实验条件各有不同，实验方法和配方并不完全一致，需结合具体实验进行合理操作，本方案来自研究院校，仅供参考。

一、实验材料与试剂准备

1.实验仪器

移液枪

涡旋震荡仪

台式离心机

酶标仪

垂直电泳槽

蛋白转膜槽

数显翘板摇床

全能型成像分析系统

2.实验试剂

2.1样本制备相关试剂

① 1×PBS缓冲液（YS0106）

② Total Protein Extraction Kit（RS0024）或RIPA裂解液

③ 蛋白酶抑制剂

④ BCA蛋白定量试剂盒

⑤ 5×SDS PAGE loading buffer（RS0015）

⑥ 预染蛋白Marker(D02-250【10-180Kda】)（D03-250【10-250KDa】)

2.2配制SDS-PAGE相关试剂

① 30% Acr-Bis(29:1)（RS0029）

② 1.5M Tris-Hcl（PH8.8）（RS0014）

③ 1.0M Tris-Hcl（PH6.8）（RS0013）

④ 10% SDS（RS0012）

⑤ 10% 过硫酸铵（APS）

⑥ 四甲基乙二胺(TEMED)

⑦ 无水乙醇

2.3电泳、转膜相关试剂及耗材

① Tris-Glycine-SDS (1×, premixed powder) Running Buffer (YS0104)

② Tris-Glycine Transfer (1×, premixed powder) Buffer (YS0111）

③甲醇

④PVDF膜/NC膜

⑤丽春红S染色液 (RS0021)

2.4封闭、抗体孵育及显影试剂

① 快速封闭液(YS0109)或5%脱脂牛奶或5%BSA

② 20×TBST Washing Buffer (RS0122)

③ Immunoway 高品质一抗

④ Immunoway HRP偶联二抗（RS0001,RS0002）

⑤ DAB显色试剂盒

2.5其他试剂

① Stripping Buffered Solution（RS0022）

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